梯度優化在液相色譜方法開發中是非常重要的一個環節。有時，一個合適的梯度洗脫程序對液相色譜分析分離可起到“四兩撥千斤”的作用。然而，許多小伙伴由于梯度優化實驗做得相對較少，因此誤認為梯度優化非常復雜。今天小編就帶大家來揭開反相液相色譜梯度程序的神秘面紗，一探梯度優化的究竟。

一、建立梯度方法的原因

Q 為什么要用梯度的方式來洗脫呢？

當然，作為分析工作者，如果能以一個等度的條件完成我們的分離目的，那便是是皆大歡喜的，但實際情況常常不能如我們所愿。混合樣品組分中，必定存在容易分離和不易分離的組分，保留較弱和保留較強的組分。

我們建立梯度洗脫程序的目的就在于，將容易分離的組分在洗脫能力較弱的流動相中實現盡快分離，而保留較強的組分在色譜柱內停留較長時間，與鍵合相表面發生充分的相互作用，盡可能地彼此拉開，后用強洗脫能力的流動相洗脫出來，避免洗脫時間過長。

二、反相液相色譜體系流動相的洗脫能力

Q 前文既然講到了流動相的洗脫能力，那么，反相色譜中，如何來判斷流動相的洗脫能力呢？

我們可以來看一下下面這張圖：

上圖各位小伙伴應該都不陌生，所述的原理即是，在反相體系中，隨著流動相的極性不斷增加（水相的比例在不斷增加），流動相整體的洗脫能力逐漸減弱，而保留時間則在逐漸延長。因此，前文中對于容易分離的組分，可嘗試在流動相極性較大的環境下將其實現分離。

同時，為了提高整個樣品混合組分的分離度，在整個梯度程序內，也盡可能使用高比例的水相作為梯度洗脫的起始條件。因此，對于很多小伙伴，在進行一個全新的項目的反相條件方法開發的時候，chang用的初始梯度模式便是在0~40min內，進行一個95%水相→100%有機相的線性洗脫。

三、反相液相色譜梯度優化中心思路

反相色譜梯度優化的中心思路，其實就是盡可能減弱流動相的洗脫能力，從而減少共洗脫的情況。減弱流動相洗脫能力y效的方式是更換洗脫強度弱一些的溶劑，或者增減流動相中的添加劑。

然而，很多情況下，小伙伴參照既定標準進行實驗，溶劑種類和添加劑的量不便進行過多的調整，這樣的情況下，還有一個方法可以調節流動相的洗脫強度，那就是減緩流動相的變化斜率。我們通過下面這個案例給大家說明：

通過上圖我們可以看到，在梯度（一）條件下，多潘立酮和雜質D出現共洗脫，峰重疊。于是我們進行梯度程序的調節：

在梯度（二）中，10min時乙腈的比例為45%，而梯度（一）下10min時乙腈的比例為60%，并且梯度（二）中的后7min，乙腈的比例也并未繼續升高至100%，這就使得梯度（二）條件中，每時每刻乙腈的比例都低于梯度（一），暨每時每刻流動相的洗脫強度都弱于梯度（一），如下圖。如此一來，各雜質共洗脫的情況得到改善，結果就是如圖3所示，8個物質都得到了分離。

四、注意事項

在進行方法開發梯度優化的時候，一定要注意兼容性的問題，包括流動相溶劑彼此之間的兼容性，以及流動相和樣品的兼容性。

流動相溶劑選擇上，h是選擇能夠任意比例互溶的溶劑。若是流動相溶劑不方便更換，則需盡量減緩流動相的變化速率，給有機相和水相（鹽相）更多的時間來互溶。

對于樣品來說，流動相的性質一定要注意與樣品溶劑能夠兼容，避免出現在進樣后的任意時刻樣品不溶解、析出的情況。